编者按
当前，脑血管疾病是威胁人类健康与生存的重大疾病之一，其中又以脑缺血较为多见，目前临床上主要的治疗方式是尽早恢复缺血区血液再灌注，使脑组织重新获得血氧供应，但常伴随脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）。
天麻（Gastrodia elata，GE）具有缓解中风、抑制肝阳、祛风通络的作用，目前已在临床实践中得到了广泛应用。我们之前的实验研究已证实，天麻对脑缺血再灌注损伤具有一定的治疗作用，但天麻治疗CIRI的有效成分尚不清楚，则需要进一步研究。
今天，我们特别回顾一项2024年11月10日发表在 《Phytomedicine》上的研究成果，该研究基于“光谱效应”分析并利用斑马鱼缺血性脑卒中模型，验证了天麻（GE）改善脑缺血再灌注损伤（CIRI）的潜在有效成分，弥补了化学成分和药效学分开研究的缺点，为天麻的临床应用提供了理论支撑，也为进一步开展中药质量评价提供了理论依据，为中药复方复杂成分的作用机制探究提供了"化学分析-活体药效-机制阐释"的研究范式。
文章题目
Exploration the effective components of Gastrodia elata in improving cerebral ischemia reperfusion injury based on “Spectrum-effect” correlation and zebrafish verification experiment
杂志：Phytomedicine（IF=7.9，中科院JCR双1区Top期刊）
发表时间：2024年11月10日
作者：桂双英教授、汪小莉教授等
单位：安徽中医药大学等图片
图1 图形摘要
01、研究亮点
1. 首次采用"谱效关系"与斑马鱼模型结合：
研究中，通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）（"谱"）与药效学指标（"效"）的关联分析，鉴定了GE在大鼠血清中的吸收成分和代谢产物，筛选出天麻中改善脑缺血再灌注损伤的潜在有效成分，并利用斑马鱼脑卒中模型，直观验证了GE活性成分的体内作用，实现了从化学表征到生物学验证的全链条研究。
2. 多维度靶向筛选，突破传统中药活性成分筛选模式：
本研究通过谱效相关性计算（如灰色关联度、偏最小二乘法等）筛选出天麻中与抗脑缺血再灌注损伤密切相关的化合物群（如天麻素、对羟基苯甲醇等），突破了单一成分研究的局限，揭示了多成分协同作用机制。
3. 利用斑马鱼模型直观验证活性成分的作用：
利用斑马鱼脑卒中模型，评价不同处理组斑马鱼的脑血栓面积大小、脑细胞凋亡程度、脑组织生化指标及血液流变学变化等，快速验证天麻提取物及关键成分——对羟基苯甲醛（PHB）、对羟基苯甲醇（PHBA）、天麻素（GA）治疗脑缺血再灌注损伤的效果。斑马鱼实验表明，PHB、PHBA和GA可通过调节氧化应激与凋亡来有效改善脑血栓形成。
4. 明确天麻中的关键活性成分：
研究发现，天麻中的天麻素（GA）和对羟基苯甲醇（PHBA）是天麻抗脑缺血再灌注损伤的核心成分，通过抑制氧化应激、调控Nrf2/HO-1通路显著减轻脑缺血损伤，为后续开发标准化中药制剂或创新药物提供了科学依据。
02、研究概述
缺血性脑卒中属于中医理论中的“中风”范畴。恢复血液供应是治疗缺血性脑卒中的最有效方法，但在治疗过程中可能会发生脑缺血再灌注损伤（CIRI）。中风是全球第三大死亡原因，而脑缺血具有高发病率、高致残率、高致死率和高复发率等特点，CIRI是脑缺血的重要病理生理环节，其病理生理机制非常复杂。中医强调治疗疾病的“整体观念”，通过多靶点、多途径来治疗脑缺血，对CIRI有较好的保护作用，且毒副作用较小，因此，亟需为CIRI患者寻找潜在有效的传统中药治疗策略。
天麻（GE）最早记载于《神农本草经》中，具有熄风止痉、平肝阳等功效。缺血性中风作为一种“风”病，CIRI常会导致不可逆的脑损伤及神经元损伤，甚至死亡，这涉及许多复杂的病理过程，如氧化应激、炎症、细胞凋亡等。已有研究表明，天麻（GE）通过减少炎症、抗氧化损伤、抑制细胞凋亡等对缺血性脑损伤（CIRI）具有保护作用，因此，探究天麻（GE）在治疗CIRI中的有效活性成分具有重要的临床意义。然而，目前对天麻（GE）具体作用成分的系统性研究还较少，需要建立一种快速有效的分析方法来阐明其化学成分及其药理基础。
中药的提取、分离方法长期存在耗时、效率低下等问题，UHPLC-Q-TOF/MS以检测范围广、检测速度快、检测结果准确等优点，被广泛用于对中药化合物进行全面表征。因此，本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS技术对GE的化学成分进行了分析，为其药理学基础研究及质量标准制定提供了参考。
现代研究表明，GE中含有酚类及其糖苷、多糖和甾醇等成分。这些成分中，酚类化合物及其糖苷已被证明与GE的药理活性密切相关。尽管已有不少对GE化学成分及药理作用的研究，但GE改善CIRI的活性成分尚不清楚。因此，找到一种有效的方法来阐明GE的主要药效物质基础非常重要。
本研究中，利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）对GE外源性化学成分及血浆药物含量进行定性分析，鉴定天麻在大鼠血清中的吸收成分及代谢产物。天麻（GE）中共检出45种化学成分，并在大鼠血清中鉴定出87种活性成分（包括25种原型成分和62种代谢产物）。
通过光谱与效应相关性分析，将化学成分的动态变化与药效学指标的动态变化联系起来，并采用药效指标与成分响应的灰色关联统计方法筛选潜在活性成分，并结果表明，天麻（GE）通过调节白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）水平改善CIRI。灰色关联统计显示，天麻中的对羟基苯甲醛（PHB）、对羟基苯甲醇（PHBA）及天麻素（GA）可能是其核心活性成分。
斑马鱼体积小、通体透明，且能够直观可视化观察其心血管系统，因此是研究血脑屏障和神经血管发育的有力工具。而且，斑马鱼血小板在结构和功能上与哺乳动物血小板具有同源性，与人类也有类似的止血过程，也是研究血栓性疾病的良好模型。因此，越来越多的研究人员通过基因编辑、药物诱导或化学诱导构建斑马鱼缺血性卒中模型，来开展药物筛选及研究。
帕纳替尼(Ponatinib)是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，已被证明具有血管毒性并可能诱导血栓形成。将其用于2dpf（受精后第二天）斑马鱼，构建斑马鱼缺血性卒中模型，该模型具有血管系统发育早、血管透明且易于成像等优势。其血栓形成、内皮损伤等病理特征也与人类缺血性卒中高度相似，能实时监测血流动态、脑血栓形成、神经损伤及修复过程，有助于探究缺血性脑损伤（CIRI）潜在机制，并寻找新的治疗靶点。
本研究中，通过在斑马鱼缺血性卒中模型中对筛选出的潜在有效成分进行药效学验证，表明对羟基苯甲醛（PHB）、对羟基苯甲醇（PHBA）、天麻素（GA）可通过调节氧化应激与细胞凋亡来有效改善脑血栓形成，从而治疗脑缺血再灌注损伤。
图2 研究机制
03、斑马鱼研究结果
本研究利用斑马鱼缺血性卒中模型，通过不同处理组斑马鱼的脑血栓面积大小、脑细胞凋亡程度、脑组织生化指标和血液流变学变化等指标进行评估，直观验证了筛选出的天麻活性成分的体内作用。
1. 脑血栓面积大小、脑细胞凋亡程度评估
与对照组相比，Ponatinib（PON）组的脑血栓区域显著增加；而与PON组相比，阳性对照组（DBT）、Gastrodin组（GA）、P-hydroxybenzyl alcohol组（PHBA）和P-hydroxybenzaldehyde组（PHB）的脑血栓区域分别显著减少了87.8%、46.8%、88.6%和84.8%。这些结果表明，GA、PHBA和PHB可以抑制PON诱导的脑血栓形成。不同组别斑马鱼脑血栓的结果见图 3 (A-B)。
为了检测细胞凋亡，在PON组的斑马鱼大脑中发现，荧光颗粒的数量显著增加，表明存在大量的脑细胞凋亡；而在DBT、GA、PHBA和PHB的处理下，斑马鱼大脑中的凋亡细胞数量显著减少，表明GA、PHBA和PHB能够有效减轻PON诱导的脑卒中所致的脑细胞凋亡。不同组别斑马鱼大脑凋亡的结果见图 3 (C-D)。
图3 脑血栓区域和细胞凋亡图
2. 脑指标生化指标检测
与正常组相比，模型组斑马鱼脑组织中的ROS、NO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著升高（P<0.01），而SOD水平显著降低（P<0.01）。与模型组相比，DBP组（阳性对照组）、GA组、PHBA组和PHB组斑马鱼脑组织中的ROS、NO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著降低（P<0.01），而SOD水平显著升高（P<0.01），如图 4（A-G）所示。
由于PON在斑马鱼中诱导血栓形成，导致血流阻塞。与对照组相比，PON组斑马鱼的动脉和静脉血流速度显著降低。在接受DBP、GA、PHBA和PHB治疗后，斑马鱼的动脉和静脉血流速度出现显著反弹，表明GA、PHBA和PHB有助于促进血流恢复，同时消除血栓。动脉血流速率和静脉血流速率的结果见图 4 (H-I)。
图4 斑马鱼药效学和血液流变学结果 (A-G) 不同药物对各组斑马鱼CIRI模型中ROS、NO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响；(H-I) 各组斑马鱼动静脉血流速度的检测结果。
04、编者点评
本研究通过UHPLC-Q-TOF/MS技术对天麻的外源性化学成分和含药血浆进行了定性识别分析，并通过谱效相关性分析将化学成分的动态变化与药效学指标的动态变化联系起来，以探究天麻改善CIRI的药效物质基础，证实天麻中的对羟基苯甲醇、天麻素及对羟基苯甲醛是其抗CIRI的核心活性成分群，其作用机制涉及Nrf2/HO-1通路激活与凋亡抑制。通过斑马鱼模型实验评估了GA、PHB和PHBA的作用，发现这些成分对改善脑缺血损伤具有一定的效果。
作为健康美丽产业CRO服务开拓者与引领者、斑马鱼生物技术的全球领导者，环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”多维生物技术服务体系，开展健康美丽CRO服务、科研服务、智慧实验室搭建三大业务。目前，环特已建立200多种斑马鱼模型，胃癌、脑类器官、心脏类器官及各种肿瘤类器官培养平台，欢迎有需要的读者垂询！